Микотоксины — стратегия устранения их влияния на организм сельскохозяйственных животных и птицы (статья 2)
Цены на НЕЙТРАЛИЗАТОРЫ ТОКСИНОВ смотрите на сайте СЕЛЬХОЗТОРГИ.РФ
М.А.Малков, В.В.Богомолов, Т.В.Данькова, К.А.Краснов
ЗАО «НПФ «ЭЛЕСТ», ФГУ Облветлаборатория (Санкт-Петербург)
В первой части нашей статьи (ЦЕНОВИК, № 1, 2012 г.) были приведены данные по сорбции шести токсинов нейтрализаторами различного состава в системе «корм–сорбент–токсин». Было показано, что при норме ввода 0,2% роль сорбентов нивелирована в значительной степени, поскольку большая часть токсинов сорбируется на субстраты корма. Мы предложили осуществлять постоянный контроль за концентрацией токсинов в кормах и при концентрации на уровне МДУ и выше увеличивать временно норму ввода до 1%.
Тем не менее ситуация в кишечнике остается неясной. Понятно, что оптимальное решение — когда в кишечнике создается минимальная концентрация токсинов, частично попадающих в кровь и подвергающихся дезактивации в печени. Однако в реальной ситуации мы показали, что для многих токсинов сорбционные связи оказываются нестойкими и они десорбируются при pH=7,2. В тоже время в кишечнике возрастает концентрация токсинов, поступающих из разрушающихся субстратов корма. Часть этих токсинов может, по-видимому, связываться со свободными центрами сорбентов, образовывать комплексы с металлами, разрушаться кишечной микрофлорой. В этой связи нам представлялось интересным оценить способность к сорбции токсинов в щелочной области для различных нейтрализаторов с известным сорбционным составом и отдельных сорбентов. Поиск сорбентов, активно связывающих токсины в щелочной области pH, либо сорбентов, обладающих такой способностью и в кислой, и щелочной зонах (желудок и кишечник), представляется одной из перспективных задач.
Материалы и методы
1 вариант:
Адсорбцию измеряют по утвержденной методике при постановке теста in vitro.
1) В колбу наливают 100 см3 жидкости, имитирующей желудочный сок (водный раствор соляной кислоты с pH=1,2);
2) вносят рассчитанное количество микотоксина, добавляют исследуемый сорбент и тщательно перемешивают;
3) выдерживают при постоянном перемешивании (с помощью магнитной мешалки) 1 час при температуре 37°C. Тем самым моделируется время нахождения корма и pH в желудке;
4) отделяют методом декантации надосадочную жидкость от осадка;
5) экстракт (вытяжку) из микотоксинов — надосадочную жидкость — исследуют на содержание микотоксина методом ИФА.
Таким образом, получают величину абсорбции — общее количество токсинов, связанных сорбентом за время нахождения корма в желудке, равную разнице между количеством токсина в контрольной пробе (без добавки сорбента) и количеством свободного токсина в растворе после инкубации в кислом растворе вместе с сорбентом.
2 вариант:
1) В колбу наливают 100 см3 жидкости, имитирующей кишечный сок (буфер PBS с pH=7,4);
2) вносят рассчитанное количество микотоксина, добавляют исследуемый сорбент и тщательно перемешивают;
3) выдерживают при постоянном перемешивании (с помощью магнитной мешалки) 1 час при температуре 37°С. Тем самым моделируются pH и время нахождения корма в проксимальном отделе кишечника, при котором возможна эффективная сорбция микотоксинов перед поступлением в кровь животного;
4) методом декантации отделяют надосадочную жидкость от осадка;
5) экстракт (вытяжку) из микотоксинов — надосадочную жидкость — исследуют на содержание микотоксина методом ИФА.
Таким образом, получают величину адсорбции — общее количество токсинов, связанных сорбентом за время нахождения корма в кишечнике, равную разнице между количеством токсина в контрольной пробе (без добавки сорбента) и количеством свободного токсина в растворе после инкубации в щелочном растворе вместе с сорбентом.
Результаты и их обсуждение
Таблица 1. Адсорбция афлатоксина В1 (МДУ= 50 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг |
в % |
в мкг/кг |
в % | ||
1 |
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
30,5 |
60,9 |
33 |
65,8 |
2 |
неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
11,2 |
22,3 |
20,8 |
41,5 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
0 |
0 |
39,2 |
78,4 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
0 |
0 |
30,6 |
61 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
9,0 |
17,9 |
22,0 |
44 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
4,2 |
8,4 |
30,0 |
60 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
1,9 |
3,8 |
3,7 |
7,4 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
9,7 |
19,3 |
6,6 |
13,2 |
Таблица 2. Адсорбция охратоксина (суммарно) (МДУ=50 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг |
в % |
в мкг/кг |
в % | ||
1 |
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
19,0 |
38 |
17,7 |
35 |
2 |
неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
37,5 |
75 |
17,4 |
34,9 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
17,9 |
35,7 |
24,4 |
48,8 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
0 |
0 |
29,0 |
58,1 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
0 |
0 |
25,6 |
51,2 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
0 |
0 |
26,7 |
53,5 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
22,5 |
44,9 |
33,7 |
67,4 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
0 |
0 |
33,7 |
67,4 |
Таблица 3. Адсорбция Т-2 токсина (МДУ=100 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг | |||||
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
6,4 |
6,4 |
4,13 |
4,13 | |
2 |
неорганический сорбент (специальным обр1азом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
0 |
0 |
0 |
0 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
0 |
0 |
0 |
0 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
0 |
0 |
0 |
0 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
0 |
0 |
0 |
0 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
0 |
0 |
0 |
0 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
2,2 |
2,2 |
0 |
0 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
0 |
0 |
0 |
0 |
Таблица 4. Адсорбция дезоксиниваленола (ДОНа) (МДУ=1000 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг |
в % |
в мкг/кг |
в % | ||
1 |
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
377 |
37,7 |
0 |
0 |
2 |
неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
220 |
2,2 |
0 |
0 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
202 |
20,2 |
0 |
0 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
136 |
13,6 |
0 |
0 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
197 |
19,7 |
0 |
0 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
272 |
27,2 |
0 |
0 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
474 |
47,4 |
0 |
0 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
237 |
23,7 |
0 |
0 |
Таблица 5. Адсорбция зеараленона (F2) (МДУ=1000 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг |
в % |
в мкг/кг |
в % | ||
1 |
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
813,0 |
81,0 |
0 |
0 |
2 |
неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
713 |
71,0 |
307 |
30,7 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
710,0 |
71,0 |
84,0 |
8,4 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
746,0 |
74,6 |
390,0 |
39,0 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
740,0 |
74,0 |
585,0 |
58,5 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
790,0 |
79,0 |
496,0 |
49,6 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
792,0 |
79,2 |
439,0 |
43,9 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
800,0 |
80,0 |
494,0 |
49,4 |
Таблица 6. Эффективность обеззараживания «Фунгистатом» комбикорма, естественным образом контаминированного зеараленоном
Концентрация «Фунгистата» в г/кг корма |
Адсорбция зеараленона | |
в мкг/кг |
в % | |
5 (0,5%) |
0 |
0 |
10 (1%) |
2494,8 |
78,2 |
20 (2%) |
3166 |
100 |
Таблица 7. Адсорбция фумонизина (суммарно) (МДУ= 5000 мкг/кг)
№ п/п |
Сорбент |
Адсорбция в кислой среде |
Адсорбция в слабо-щелочной среде | ||
в мкг/кг |
в % |
в мкг/кг |
в % | ||
1 |
Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды |
4,89 |
97,8 |
0 |
0 |
2 |
неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент |
4,62 |
92,4 |
0 |
0 |
3 |
смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты |
4,58 |
91,6 |
0 |
0 |
4 |
сорбент органической природы (полисахариды) |
4,75 |
95,0 |
0 |
0 |
5 |
бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения |
4,49 |
89,8 |
0 |
0 |
6 |
глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты |
4,52 |
90,3 |
0 |
0 |
7 |
модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты |
4,84 |
96,7 |
0 |
0 |
8 |
клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный |
4,72 |
94,4 |
0 |
0 |
В табл. 1–7 приведены результаты исследований сорбционной способности различных сорбентов, представленных в составе наиболее эффективных нейтрализаторов токсинов. В данном случае конкурентный фон в виде субстратов корма отсутствовал, т.е. в модельных опытах были изучены сорбенты различной природы в «чистом виде» в кислой и щелочной зонах. В предыдущем исследовании (часть I статьи рис. 1 «ЦЕНОВИК» № 1-2012) было показано, что в условиях конкурентности с субстратами корма данные по сорбции токсинов различными нейтрализаторами очень близки, за отдельными исключениями. Несмотря на очевидную разницу в составе сорбентов, у нейтрализаторов токсинов исключение составляют зеараленон и фумонизин. Как мы видели, связывание таких микотоксинов, как афлатоксин, Т-2 токсин, ДОН и охратоксин субстратами корма является определяющим и, по сути, не важно, какой именно нейтрализатор токсинов вводится в эту систему при норме 0,2%. Удержание этих токсинов на субстратах корма осуществляется, по-видимому, за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий, но не за счет специфического связывания. В силу своей химической структуры первые три токсина вообще не склонны к комплексообразованию. Для охратоксина в принципе можно подобрать комплексообразующий реагент, но, судя по нашим данным, ни один из компонентов кормовой смеси и ни один из сорбентов не комплексует охратоксин. Напротив, зеараленон и фумонизин весьма склонны к образованию комплексов с рядом компонентов металлов. Такими металлами могут быть алюминий, железо, медь, переходные металлы. Точный состав сорбентов и кормовой смеси неизвестен, но алюминий во всех исследованных сорбентах присутствует (алюмосиликат, бентонит, глины и др.), встречается медь, железо. Результаты, полученные нами, свидетельствуют о необратимой и высокой сорбции указанных токсинов всеми нейтрализаторами, что связано с их комплексообразованием.
Иная картина наблюдается в неконкурентных условиях (табл. 1–7). Прежде всего, мы видим, что ряд сорбентов не обладает способностью к связыванию токсинов в слабощелочной среде (условия кишечника).
В этой области с сорбентами не связывается ДОН, фумонизин и Т-2 токсин (в этом случае «работает» только «Фунгистат» в некоторой степени — 4,2%). Чем объяснить крайне низкую сорбцию Т-2 токсина для разных сорбентов? При рассмотрении структур 6 токсинов можно отметить следующее (формулы на рис. 1):
Рис. 1
Охратоксин, зеараленон и фумонизин довольно полярны и содержат протонодонорные функции, благодаря чему склонны к связыванию с полярными сорбентами (окись алюминия, алюмосиликаты, кремнензем и др.). Афлатоксин гораздо менее полярен, но обладает плоской сопряженной системой, способной к связыванию на сорбентах и компонентах кормовой смеси за счет дисперсионных π-π взаимодействий. Хуже связываются ДОН и Т-2 токсин, обладающие неплоским каркасным скелетом и сравнительно невысокой полярностью. Но если молекула ДОН имеет сопряженный фрагмент, хотя и небольшой, но все-таки способный к π-π взаимодействиям (имеется ввиду С=С связь, сопряженная с С=О группой), а также 2 протонодонорных гидроксигруппы, то в случае Т-2 токсина, где нет элементов сопряжения и содержится всего одна гидроксигруппа, возможности к связыванию с сорбентом совсем мизерны.
Таким образом, низкая сорбция Т-2 токсина по сравнению с остальными 5 микотоксинами вполне объяснима его структурными особенностями.
Зеараленон и фумонизин
В случае зеараленона и фумонизина результаты сорбции интерпретировать достаточно просто. Фумонизин содержит 4 карбоксильные группы, из которых 3 свободны от внутримолекулярного солеобразования. В кислой среде ионизация карбоксигрупп подавлена (схема 1), поэтому молекула фумонизина находится в виде катиона или нейтрального цвиттер-иона и хорошо сорбируется. В слабощелочной среде при pH=7,3 эти 3 карбоксигруппы ионизируются, и в результате резко увеличивается гидрофильность молекулы, то есть сродство к водной фазе. Соответственно, фумонизин хорошо сорбируется в кислой среде и плохо — в слабощелочной.
Фумонизин в кислой среде (pH=1.2) Фумонизин в слабощелочной среде (pH=7.3)
Аналогичная ситуация возникает в случае зеараленона. В кислой среде ионизация зеараленона подавлена (схема 2), что способствует его сорбции. В слабощелочной среде (pH=7,3) зеараленон ионизируется, хотя не полностью. Этого достаточно, чтобы резко понизилась сорбция при pH=7,3.
Нейтральная форма Ионизованная форма
Ранее мы показали («Животноводство России», № 1–2, 2010 г.), что при переходе из кислой в слабощелочную среду в экспериментах на смеси корм–сорбент–токсин десорбция фумонизина и зеараленона не происходит. Дело в том, что если бы удерживание на смеси корм–сорбент было исключительно за счет неспецифической сорбции, то десорбция наверняка наблюдалась. Но как мы уже выше упоминали, удержание фумонизина и зеараленона на смеси обусловлено в значительной степени комплексообразованием. Если комплекс образовался, то его разрушение требует значительной энергии (более 10 ккал/моль), и последующая смена pH раствора уже не изменяет связанное состояние токсина. Отсутствие десорбции явилось бы положительным фактором, если бы не очевидное разрушение корма в кишечнике под влиянием ферментов. В этом случае освободившиеся токсины, не имея возможности сорбции на сорбентах, попадут в русло крови и далее в печень.
Охратоксин
Нейтральная форма Ионизованная форма
Несколько сложнее обстоит дело с охратоксином. В кислой среде молекула охратоксина нейтральна, а в слабощелочной — ионизирована (схема 3). Нейтральная форма охратоксина менее гидрофильна и при прочих равных условиях должна была бы лучше сорбироваться из водного раствора. Но в ионизированной форме в молекуле возникают более сильные внутримолекулярные водородные связи, которые делают молекулу более плоской и усиливают донорно-акцепторное связывание с плоскими фрагментами сорбента.
Вторая тенденция, очевидно, играет более существенную роль, так как для шести сорбентов (см. табл. 1–7) сорбция в слабощелочной среде сильнее, чем в кислой. Тем не менее возможен и обратный эффект: так, на сорбенте 2 (табл. 2) с алюмосиликатами сорбция в кислой среде сильнее, чем в слабощелочной, а на «Фунгистате» (1) сорбция в кислой и щелочной зонах практически одинакова. В какой-то степени это можно объяснить свойством алюмосиликатов, присутствующих в составе двух сорбентов, но более правдоподобно данная особенность объяснима присутствием каких-то липидных соединений в сорбентах. Скорее всего, именно липиды отвечают за сорбцию охратоксина в кислой среде.
Афлатоксин В1
Молекула афлатоксина нейтральна и ее форма не изменяется при смене pH раствора. Поэтому различие в сорбирующей способности сорбентов по отношению к афлатоксину следует искать в самих сорбентах и их трансформациях под влиянием pH. Как видно из результатов, для семи сорбентов, содержащих те или иные органические субстанции (в т.ч. различные полисахариды), сорбция в слабощелочной среде выше, чем в кислой. Для двух (3, 4 поз. табл. 1), содержащих в рецептуре повышенные количества полисахаридов, сорбция в кислой среде вообще отсутствует. Можно предположить, что причиной этому является экранирование полисахаридных цепочек органических сорбентов в кислой среде, в том числе с участием ионной сольватации (катионами алюминия, кальция, меди и др.). Заметим, что в кислой среде данные ионы приобретают активность, в отличие от щелочной среды. В результате такой сольватации экранируются и дезактивируются центры органических сорбентов, отвечающие за сорбцию малополярных веществ, в частности афлатоксина. Однако и чисто алюмосиликатные сорбенты обладают весьма незначительной сорбцией афлатоксина как в кислой, так и в слабощелочной зонах, поэтому ограничение сорбентов более предпочтительно. Исключением является «Фунгистат ГПК» (табл. 1), который имеет не доминирующую органическую часть (гепатопротекторный белок), однако основное — это наличие двух различных по природе сорбентов, обеспечивающих высокий уровень сорбции афлатоксина при различных pH.
ДОН
Молекула ДОНа, как и в предыдущем случае, нейтральна, и ее форма не изменяется при смене pH раствора. Но, в отличие от афлатоксина, ДОН содержит 2 гидроксильные группы и способен к образованию водородных связей с полярными кислородсодержащими группами. Например, (Х)Al=0 или (X2)Si=0. По данным табл. 4, связывание ДОНа происходит только в кислой среде, из чего можно заключить важность трансформации алюминий-кремниевых компонентов сорбента под влиянием кислоты. Вероятно, сорбция ДОНа в кислой среде возникает за счет перевода концевых гидроксигрупп в оксигруппы по реакции (Х)Al(OH)2 + H + →(Х)Al=0 + H2O. Данные табл. 4 показывают, что молекулы ДОН на всех изученных сорбентах связываются максимально до 47% и только в кислой области pH. При этом наиболее эффективной является сорбция на алюмосиликатах, хуже на модифицированных и органических сорбентах. «Фунгистат» сорбирует 37% ДОН.
Т-2 токсин
Приведенные выше рассуждения о сорбции ДОНа применимы также и для Т-2 токсина. Разница состоит в том, что Т-2 токсин еще менее полярен, чем ДОН, и сорбируется еще хуже, сказать точнее, вообще почти не сорбируется. Некоторая сорбция наблюдается на «Фунгистате», что, скорее всего, связано с наличием в нем двух сорбентов.
Причины плохой сорбции Т-2 токсина, связанные с его структурными особенностями, изложены выше. Вероятно, изученные сорбенты малопригодны для извлечения Т-2 токсина из водных сред. Полярные композиции вряд ли могут быть эффективны для этой цели. Необходим поиск других типов сорбентов.
Обсуждение результатов
Представленные ранее данные по сорбции в системе корм–сорбент–токсины показали, что сорбция токсинов на корм является определяющей, и сорбенты становятся малоконкурентными. Единственный выход — оперативное изменение концентрации сорбентов в соответствии с возникающей нагрузкой токсинами кормов и зерна. Здесь, однако, есть опасность такой эйфории, когда незначительные концентрации токсинов (по нормам ниже МДУ) могут восприниматься некоторыми «cost-killers» (специалисты с задачей снижения себестоимости), как сигнал к полному изъятию нейтрализаторов токсинов из состава кормов. В конечном результате это приведет к хроническому токсикозу, а в случае проскока — к длительному гепатозу со всеми последствиями. В то же время из вышеизложенных материалов следует, что сорбенты и в условиях отсутствия конкуренции обладают различной способностью к сорбции токсинов в кислой и слабощелочной зонах. Ряд токсинов, как мы видели, вообще не обладает способностью к сорбции на любых сорбентах в слабощелочной зоне pH, и мы попытались объяснить эти наблюдения. Поиск сорбентов, обладающих каким-то унифицированным действием на токсины и в то же время промышленно доступных, малоперспективен.
Количество показов: 3603
Автор: М.А.Малков, В.В.Богомолов, Т.В.Данькова, К.А.Краснов, "ЦЕНОВИК" февраль 2012
Материалы по теме:
МикАцид | Аддкон XF Superfine | Мико Карб | СабКонтрол Плюс | Элитокс |