Ветеринария

25.05.2018

Достижение в области вакцинации против ньюкаслской болезни

Рекомбинантная вакцина на основе герпесвируса индеек обеспечивает высокую степень защиты и уменьшает распространение вируса при отсутствии побочных реакций.

Вирус ньюкаслской болезни (ВНБ) обычно вызывает респираторные, желудочно-кишечные или нервные симптомы. При самой тяжелой форме ньюкаслской болезни (НБ) смертность превышает 90%.

ВНБ принадлежит к семейству парамиксовирусов птиц. Геном вириона ВНБ, покрытого оболочкой, представлен одной отрицательно-полярной нитью РНК длиной примерно 15 тыс. нуклеотидных оснований и полностью реплицируется в цитоплазме. Геном кодирует шесть белков: РНК-зависимую РНК-полимеразу (L), гемагглютинин-нейраминидазу (HN), белок слияния (F), матриксный белок (М), фосфопротеин (Р) и нуклеопротеин (N). В результате посттранскрипционных изменений мРНК гена Р образуется два неструктурных белка — V и W. Белок V играет прямую роль в репликации вируса. Поверхностные гликопротеины F и HN являются основными антигенами, вызывающими иммунный ответ.

Существующие вакцины против НБ способны предотвратить симптомы болезни, однако не препятствуют инфицированию, выделению вируса и заражение других птиц. Кроме того, эффективность вакцин различается в зависимости от штамма. И наконец, материнские антитела препятствуют созданию раннего и устойчивого иммунитета после однократной вакцинации суточных цыплят.

Многообещающим подходом, позволяющим устранить эти недостатки, является использование векторных вакцин на основе герпесвируса индеек (HVT), содержащего и экспрессирующего защитные белки, особенно F и HN. Показано, что rHVT, как и ВНБ, длительно сохраняется в организме, поэтому экспрессия гена F измерима даже спустя 30 недель после однократной подкожной вакцинации суточных цыплят. Кроме того, иммунный ответ на вакцинный вирус меньше зависит от материнских антител. Такая вакцина безопасна, так как не влияет на выводимость и сохранность.

В настоящем исследовании цыплят вакцинировали методом in ovo или в суточном возрасте в инкубатории; для оценки выделения вируса в среду применяли количественную ПЦР в реальном времени после обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Материалы и методы

Цыплята. Для исследования использовали 18-суточные оплодотворенные яйца и суточных цыплят-бройлеров кросса Ross 308, в крови которых присутствовали материнские антитела к ВНБ. После выведения цыплят помещали в изоляторы.

Вакцины и штамм для заражения. Для исследования использовали замороженную рекомбинантную вакцину на основе HVT, экспрессирующую F-белок авирулентного штамма НБ — D26/76 (Вектормун® HVT NDV, Сева-Биомун). Вакцину разводили в 100 мкл соответствующего разбавителя для получения одной дозы для вакцинации in ovo или в 200 мкл для подкожного введения.

Для заражения использовали мексиканский штамм висцеротропного вирулентного ВНБ D516/1/2008 генотипа V.

Измерение гуморального иммунного ответа. Гуморальный иммунный ответ измеряли методом задержки гемагглютинации с использованием штамма Ла Сота в качестве антигена, а также метода ИФА для обнаружения специфичного IgG (BioCheck, Голландия) согласно инструкциям производителя.

Организация эксперимента. Две группы цыплят вакцинировали in ovo (100 мкл/яйцо), либо подкожно (200 мкл/цыпленка) сразу после выведения. Третья группа (невакцинированная) служила контролем. Затем по 20 цыплят из каждой группы заражали вирулентным штаммом ВНБ в возрасте 20, 27 и 40 дней. Перед заражением отбирали пробы сыворотки для анализа. После заражения у 10 произвольно выбранных птиц брали мазки из ротоглотки и клоаки на 3 и 7-й день (или в день смерти). Диагноз НБ подтверждали по результатам вскрытия и гистологического исследования погибших и больных птиц. Защитные свойства вакцины оценивали по смертности и клиническим признакам НБ.

Статистический анализ. Выделение вируса из организма анализировали с помощью дисперсионного анализа, статистическую значимость определяли как Р<0,05.

Результаты

Выводимость после вакцинации in ovo составила 92,5%. К 4-недельному возрасту у некоторых вакцинированных птиц уже обнаруживался активный гуморальный ответ методом задержки гемагглютинации. В течение следующих недель титры прогрессивно увеличивались.

Уже к 3-недельному возрасту у вакцинированных цыплят по сравнению с контрольными достигался значимый уровень защиты (57–81%). Ко времени второго (27 дней) и третьего (40 дней) заражения защита еще более усилилась, достигнув 96–100%, как после вакцинации in ovo, так и подкожно (рис. 1).

На рис. 2 и 3 показано выделение вируса из организма после последовательного заражения. В вакцинированной группе отмечено стойкое снижение числа птиц, выделяющих вирус, и количества выделяемых вирусных частиц с возрастом, в то время как в контрольной группе выделение оставалось практически неизменным. Провести реальное сравнение по степени выделения вируса в вакцинированной и контрольной группе при отборе проб на 7-й день не представлялось возможным, так как большинство невакцинированных птиц к этой дате погибло, причем перед смертью выделение вируса было исключительно интенсивным (>8 log10 EID50/мл). Следует отметить, что контрольные птицы, дожившие до 7-го дня после второго и третьего заражения, выделяли значительно больше вируса, чем на 3-й день (рис. 3). Возможно, это связано с наличием остаточных материнских антител, задерживающих репликацию вируса, но не способных предотвратить клинические симптомы и гибель.

 

Рис. 1. Клиническая защита цыплят против велогенного штамма вируса НБ

Рис. 2. Частота выделения цыплятами велогенного штамма вируса НБ после их заражения: а) в 20-дневном возрасте; б) в 27-дневном возрасте; в) в 40-дневном возрасте

   

Рис. 3. Количество велогенного штамма вируса НБ в ротоглоточных и клоакальных мазках вакцинированных цыплят после заражения: а) в 20-дневном возрасте; б) в 27-дневном возрасте; в) в 40-дневном возрасте

Титр велогенного вируса в вакцинированной группе достигал пика (7,7–8,2 log₁₀ EID₅₀/мл) на 7-й день после первого заражения; в контрольной группе эти значения были всегда выше или около 8,0 log₁₀ EID₅₀/мл после заражения в разном возрасте (рис. 3). Большинство птиц контрольной группы также выделяли велогенный вирус в окружающую среду при их заражении в 27-суточном возрасте (более 8,0 log₁₀ EID₅₀/мл), в то время как у 40–50% птиц вакцинированной группы выделение вируса было значительно ниже.

Обсуждение

Ранняя вакцинация традиционными вакцинами против НБ небезопасна, кроме того, созданию иммунитета препятствуют материнские антитела. Текущие стратегии вакцинации позволяют предотвратить серьезное заболевание и смертность птиц, однако выделение вируса в окружающую среду все еще является критическим параметром. Настоящее исследование проведено для оценки развития иммунитета и уровня защиты от клинического заболевания и выделения вируса после применения рекомбинантной вакцины на основе rHVT, экспрессирующего F-ген в некодирующей области между UL45 и UL46 под контролем бета-актинового промотора (Вектормун® HVT NDV, Сева-Биомун), в присутствии материнских антител.

Известно, что HVT вызывает стойкую виремию у цыплят (не менее 8 или даже 30 недель после вакцинации), что позволяет предоставлять антигены иммунной системе в течение длительного времени и, следовательно, индуцировать длительный иммунитет.

F-ген в качестве вставки в вектор обеспечивает хорошую иммуногенность и защитные свойства, наряду с HN.

Наши исследования показывают, что вакцинация цыплят векторной вакциной против НБ in ovo или методом подкожной инъекции в суточном возрасте обеспечивает полную клиническую защиту к 4-недельному возрасту. Кроме того, иммунизация цыплят векторной вакциной эффективно снижает выделение велогенного вируса, тем самым значительно ограничивая передачу инфекции.

Количество показов: 2682
Автор:  В. Палья, «Сева Санте Анималь»
Источник:  "Ценовик" Май 2018
Компания:  CEVA Sante Animal / СEBA Санте Анималь