Корма и кормовые добавки

06.10.2022

Как правильно сконструировать нейтрализатор токсинов

Вокруг проблемы устранения токсинов из корма достаточно много спекуляций. Каждый производитель так называемых нейтрализаторов токсинов считает необходимым представить ситуацию таким образом, что эффективность сорбции всех токсинов, включая трихотецены, составляет не менее 80–90% при норме ввода 0,2% и меньше. Не всегда указывается нагрузка токсинов в кормах. Это важно, поскольку низкая норма ввода сорбентов (0,2%) при нагрузке на уровне ПДК не может обеспечить высокий уровень сорбции токсинов, в частности трихотеценовой группы (Т-2 и др.). То есть этого не может быть, потому что не может быть никогда. Для улучшения понимания ситуации с сорбцией токсинов на неорганических сорбентах мы предлагаем рассмотреть химическую структуру отдельных токсинов (рис. 1) и прогнозировать возможные механизмы сорбции.

Рис. 1. Структура токсинов

Т-2 токсин, ДОН. Эти токсины обладают неплоским каркасным скелетом и сравнительно невысокой полярностью, но если молекула ДОН имеет сопряженный фрагмент, хотя и небольшой, но все-таки способный к π-π взаимодействиям (имеется ввиду С=С связь, сопряженная с С=0 группой), а также две протонодонорные гидроксигруппы, то в случае Т-2 токсина, где нет элементов сопряжения и содержится всего одна гидроксигруппа, возможности к связыванию с сорбентами совсем мизерны, тем более в щелочной среде.

Таким образом, можно предполагать, что используемые в составе нейтрализаторов природные сорбенты (цеолиты, бентониты и др.) не могут обладать какой-либо значимой емкостью по Т-2 в связи с особенностями его структуры. 10 лет назад нами были проведены исследования, подтверждающие эти обстоятельства.

Тем не менее нами были найдены и включены в состав нейтрализатора токсинов Фунгистат ГПК композиции природных цеолитов, бентонитов, способные обеспечить некоторую сорбцию трихотеценов даже в условиях нагрузки на уровне МДУ. Нами использованы два сорбента с оптимальным составом, а именно монтмориллонит коллоид (23–25%), опал-кристобалит (45–52%), а также кальций (1–5%), гидрослюда (2–4%). Далее мы установили, что если норму ввода найденных сорбентов увеличить до 1% (избыток) в случае высоких нагрузок токсинов, то эффективность сорбции возрастает до 84%.

Как можно объяснить такой эффект усиления сорбции? Известно, что диспергированные алюмосиликаты содержат в своем составе частицы, обладающие сложной наноструктурой: в частности, они могут содержать наноразмерные поры, ячеистые системы с диаметром от 1–2 нм до нескольких сотен нм. Размер и удельное содержание таких нанопор зависит от происхождения материала и способа обработки. Размеры молекулы Т-2 токсина соответствуют нанопорам с диаметром примерно 1,5–2,5 нм. Попадание молекулы Т-2 токсина в такую ячейку приведет к специфической и практически необратимой сорбции данной молекулы. Это особый эффект (специфическая сорбция), однако для него характерна низкая сорбционная емкость. Такое воздействие проявляется только при большом избытке сорбента к сорбирующему веществу. Причина в том, что содержание нанопор, соответствующих размеру молекулы Т-2 токсина, относительно невелико, статистически такие поры попадаются примерно одна на сотню других.

Поэтому можно предположить, что 1 кг сорбента способен специфически связать никак не более 1 г токсина (необходимо оценить в эксперименте). Однако та доля токсина, которая свяжется специфически, будет связана прочно и практически не будет десорбироваться. В этой связи не следует питать никаких иллюзий и надеяться, что при высоких нагрузках токсинов можно получить какую- то заметную сорбцию при нормах ввода 0,2% и ниже. Подобные утверждения — это введение покупателя в заблуждение в отношении свойств продукта и, следовательно, уже недобросовестная конкуренция. Поэтому применительно к Фунгистат ГПК мы рекомендуем использовать норму ввода найденных нами сорбентов в пределах 0,5–1% на тот период, пока не будет снижена нагрузка токсинов в кормах, что позволит вернуться к обычным нормам ввода.

Охратоксин является достаточно активным и обладает протонодонорными свойствами, благодаря чему хорошо связывается с полярными сорбентами (окись алюминия, алюмосиликат, кремнезем и др.). Для охратоксина в принципе можно подобрать комплексообразующий реагент, но, по нашим данным, ни один из компонентов кормовой смеси и ни один из сорбентов не образует комплекс с охратоксином. Нами установлено, что сорбция охратоксина для разных сорбентов при норме ввода 0,2% на уровне МДУ составляет в кислой среде от 35 до 44%, в щелочной — от 35 до 67%.

ДОН (дезоксиниваленол). Молекула ДОН нейтральна, и ее форма не изменяется при смене pH раствора. Но в отличие, например, от афлатоксина, ДОН содержит две гидроксильные группы и способен к образованию водородных связей с полярными кислородсодержащими группами. Например, (х) Al=0 или (х2) Si=0 связывание ДОН происходит только в кислой среде, при этом максимум связывания составляет 47% при норме ввода 0,2%. 

Зеараленон и фумонизин. Оба токсина достаточно полярны и содержат протонодонорные группы, благодаря чему склонны к связыванию с полярными сорбентами (окись алюминия, алюмосиликаты, кремнезем и др.)

Фумонизин содержит 4 карбоксильные группы, из которых 3 свободны от внутримолекулярного солеобразования. В кислой среде ионизация карбоксигруппы подавлена, поэтому молекула фумонизина находится в виде катиона или нейтрального цвиттер-иона и хорошо сорбируется. В слабощелочной среде при pH 7,3 эти три карбоксигруппы ионизируются, и в результате резко увеличивается гидрофильность молекулы, то есть сродство к водной фазе. Соответственно, фумонизин хорошо сорбируется в кислой зоне и не сорбируется в слабощелочной.

Аналогичная ситуация возникает в случае зеараленона. В кислой среде ионизация зеараленона подавлена, что способствует его сорбции. В слабощелочной среде зеараленонионизируется, хотя и не полностью. Этого достаточно, чтобы резко понизилась сорбция при pH 7,3. Ранее («Животноводство России», № 1–2, 2010 г.) мы показали, что при переходе из кислой в слабощелочную среду в экспериментах на смеси корм–сорбент–токсин десорбция фумонизина и зеараленона не происходит. Дело в том, что если бы удерживание на смеси корм–сорбент было исключительно за счет неспецифической сорбции, то десорбция наверняка бы наблюдалась. Но, как мы выше упоминали, удержание фумонизина и зеараленона на смеси обусловлено в значительной степени комплексообразованием. Если комплекс образовался, то его разрушение требует значительной энергии (более 10 ккал/моль) и последующая смена pH раствора уже не изменяет связанное состояние токсина. Отсутствие десорбции явилось бы положительным фактором, если бы не очевидное разрушение корма в кишечнике под влиянием ферментов и микробиоты кишечника. В этом случае освободившиеся токсины, не имея возможности сорбции на сорбентах в условиях слабощелочной среды, попадут в русло крови и далее в печень.

Афлатоксин. Молекула афлатоксина нейтральна, и ее форма не изменяется при смене pH раствора. Поэтому различия в сорбирующей способности сорбента по отношению к афлатоксину следует искать в самих сорбентах и в их трансформациях под влиянием pH.

Как видно из результатов табл. 1, для всех сорбентов, содержащих те или иные органические субстанции (например, различные полисахариды), сорбция для афлатоксина в слабощелочной среде выше, чем в кислой. Для двух из них (3, 4 поз. табл. 1), содержащих в рецептуре повышенное количество полисахаридов, сорбция в кислой среде вообще отсутствует. 

Таблица 1

Адсорбция афлатоксина В1 (МДУ 50 мкг/кг)

№ п/п	Сорбент	Адсорбция в кислой среде		Адсорбция в слабощелочной среде
		в мкг/кг	в %	в мкг/кг	в %
1	Фунгистат — алюмосиликаты + бентониты + органические кислоты + гепатостимуляторы + протеолитический комплекс + фунгистатики + нуклеозиды	30,5	60,9	33	65,8
2	Неорганический сорбент (специальным образом обработанные цеолиты) + биотрансформирующий фермент	11,2	22,3	20,8	41,5
3	Смесь из адсорбентов + дрожжи + соли пропионовой кислоты	0	0	39,2	78,4
4	Сорбент органической природы (полисахариды)	0	0	30,6	61
5	Бентониты + дрожжи + полисахариды растительного происхождения	9,0	17,9	22,0	44
6	Глинистые субстанции + продукты переработки дрожжей + органические кислоты + антиоксиданты + растительные экстракты	4,2	8,4	30,0	60
7	Модифицированные бентониты, минералы, силикаты, хелаты	1,9	3,8	3,7	7,4
8	Клиноптилолит, природный минерал, специальным образом обработанный	9,7	19,3	6,6	13,2

Можно предположить, что причиной этому является экранирование полисахаридных цепочек органических сорбентов в кислой среде, в том числе с участием ионной сольватации (катионами алюминия, кальция меди и др.). Заметим, что в кислой среде данные ионы приобретают активность, в отличие от нахождения в щелочной среде. В результате такой сольватации экранируются и дезактивируются центры органических сорбентов, отвечающие за сорбцию малополярных веществ, в частности афлатоксина. Однако часто алюмосиликатные сорбенты обладают весьма незначительной сорбцией афлатоксина как в кислой, так и в слабощелочной средах. Исключением является Фунгистат ГПК, который имеет недоминирующую органическую часть (гепатопротектор), однако его основное преимущество — это наличие двух различных по природе сорбентов, обеспечивающих высокий уровень сорбции афлатоксина при различных pH.

Все токсины связаны с кормом, по-видимому, за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий. Это обстоятельство следует учитывать, поскольку так или иначе корм подвергается деструкции микробиотой кишечника, рубца и толстого кишечника, а также собственными ферментами животных и птицы. В этом случае важно понять дальнейшую судьбу токсинов. Свободные от корма токсины, как хотелось бы думать, должны сорбироваться на соответствующих минеральных или органических сорбентах. Что касается органических сорбентов, например сухой биомассы дрожжей, других микроорганизмов, водорослей и т.д., то очевидно, что они будут утилизированы живой и растущей микробиотой и токсины будут снова на свободе. Существует много публикаций о потенциально возможной сорбции токсинов на органических сорбентах, но мы не нашли исследований о дальнейшей судьбе токсинов. В соответствии с вышеизложенным, при нагрузке токсинов в кормах на уровне МДУ емкость сорбции на нейтрализаторах недостаточна при нормах ввода 0,2%, и в этом случае высокие дозы токсинов попадут в русло крови и печень. Необходимо также понимать, что значительная часть активных центров на сорбентах при деструкции кормов будет занята витаминами, аминокислотами, микроэлементами, ионами двухвалентных металлов. Поэтому при конструировании отечественного нейтрализатора токсинов Фунгистат ГПК мы не только полностью исключили использование импортных компонентов и создали научно обоснованную композицию из неорганических сорбентов, но и сопроводили ее правилами оптимальной дозировки, как было показано выше.

Глюконеогенез в печени нарушается при захвате токсинов. На самом деле это наиболее серьезное повреждающее действие токсинов. Было установлено, что захват токсинов гепатоцитами печени приводит к торможению синтеза РНК и белков в гепатоцитах, что соответственно значительно снижает скорость синтеза глюкозы крови. Это, в свою очередь, создает дефицит энергии для производства целевых продуктов у сельскохозяйственных животных и птицы, снижает иммунитет, ухудшает конверсию корма. Также известно, что единственным путем блокировки захвата токсинов гепатоцитами печени является использование антиоксидантов, в том числе флавоноидов, которые способны занимать активные центры в гепатоцитах. При конструировании Фунгистата ГПК мы предусмотрели необходимость такой функции и ввели в состав продукта антиоксиданты в найденной концентрации.

Возможно ли в широком масштабе использовать ферменты для дезактивации микотоксинов?

В настоящее время имеется достаточно много исследований на эту тему. Известно, что ряд штаммов микроорганизмов обладает способностью к деструкции токсинов. Также в мире выпускаются нейтрализаторы токсинов с включением в их состав ферментов, инактивирующих определенные токсины (например, Т-2 токсин). Разумеется, стоимость таких сорбентов достаточно высока. Мы установили недавно, что штамм Lactobacillus acidophilus обладает способностью к деструкции афлатоксина, и в настоящее время организовали собственное производство закваски на основе этого штамма с использованием ее в составе жидкого сорбента Хитолоза. Однако установленные факты разрушения отдельных токсинов определенными видами микроорганизмов не означают, что все токсины подпадают под это правило. Вместе с тем достаточно много спекуляций на эту тему. В список тотальных деструкторов попадают в том числе обычные штаммы Вac. subtilis. Известно, что для такого рода заявлений необходимо несколько лет серьезных исследований. Хотя и так очевидно, что этого не может быть. Тем не менее микробиота рубца и кишечника моногастричных может при определенных условиях выступить в качестве серьезного деструктора токсинов.

Что это за условия? Прежде всего необходимо понимать, что токсины, большинство которых образуются грибами рода Fusarium, Penicillium, Aspergillus и др., относятся, как известно, к вторичным метаболитам наряду с антибиотиками, пигментами, каротиноидами, для бактерий — полипептидами, нуклеозидами, витаминами. Для этой группы веществ различной структуры характерно одно общее свойство: они образуются в условиях замедления роста продуцентов, поэтому вторичны. Почему они образуются именно в этот период — III–IV фаза развития грибов и «стационарная» фаза бактерий? 

После долгих дискуссий ученые пришли к выводу, что активный синтез вторичных метаболитов — это вынужденная реакция клетки преобразовывать и запасать в определенной структурной форме (эволюционно обозначенной для каждого вида) значительный избыток углеводов, белков, полисахаридов, липидов, невостребованных для процессов роста и в ряде случаев токсичных для самого продуцента. Вторичные метаболиты обладают антагонизмом как в отношении различных микроорганизмов, так и в отношении макроорганизма сельскохозяйственных животных и птицы. Поэтому термин «токсины» является достаточно условным и во многом зависит от дозы. 

Очень показателен пример с продуцентом Penicillium patulum, который образует одновременно два метаболита: патулин — хорошо известный токсин для сельскохозяйственных животных и птицы и гризеофульвин — противогрибковый антибиотик, используемый в медицине, который при длительном применении также обладает токсическим действием. В последней фазе развития продуцента при снижении содержания углеводов до 0,3–0,4% происходит деградация обоих метаболитов с различной скоростью, то есть эти продукты в условиях голодания культуры используются в качестве источников углерода и энергии. 

Из практики хорошо известно, что вторичные метаболиты — антибиотики — быстро деградируют в условиях голодания продуцентов по глюкозе. Также установлено, что в условиях обсемененности целевых продуктов происходит их значительная деградация при хранении. Мы предположили, что при создании голодных условий в рубце коров и кишечнике моногастричных токсины, поступающие с кормом, могут разрушаться микробным сообществом. 

Каким образом можно создать такие условия? Мы провели серию исследований, выбрав в качестве модели группу коров в раздое в весенний период, когда силос (и корм) имеют значительную нагрузку по токсинам. В качестве контроля использовали группу коров в раздое с низкой нагрузкой по токсинам (свежий силос). Обе группы животных находились на концентратном кормлении, соответственно, с прогнозируемыми результатами.

На рис. 2, где приведены данные по «персистентности» лактационных кривых, показано, что устойчивость лактационной кривой не превышает 75% (рис. 2, кривая 1), причем в условиях повышенной токсичности она заметно ниже (рис. 2, кривая 2). 

Рис. 2. Лактационная кривая при введении в рацион Фунгистат ГПК на фоне повышенной нагрузки токсинов

В обеих группах мы наблюдаем низкую биоусвояемость концентратов и грубых кормов, тогда как при введении Фунгистат ГПК достигалась идеальная биоусвояемость (рис. 3).

Рис. 3. Промывка навоза на анализаторе переваривания NASCO. Промывка имеет идеальные пропорции; верхнее сито — полностью перева- ренная клетчатка, среднее сито — нормально сформированный мат, нижнее сито — полностью переваренная мелкая неусваиваемая фракция

Это вполне объяснимо, если принять во внимание депрессирующую роль глюкозы в рубце, действие токсинов в отношении роста микробиоты и, как конечный результат, инсулинрезистентность и снижение молочной продуктивности. Как было ранее установлено, начало деструкции вторичных метаболитов коррелирует со снижением концентрации легкоусвояемых углеводов до 0,3–0,4% и повышением pH в культуральной жидкости. 

Поскольку в рубце коровы и кишечнике моногастричных имеет место совместное культивирование многих видов микробиоты, необходимо создать условия для возникновения давно известного феномена «диауксии», когда снижение концентрации глюкозы и ее катаболитов до определенного уровня индуцирует активность ферментных систем, расщепляющих более сложные молекулы, в том числе вторичные метаболиты, к которым относятся и токсины. С целью анализа ситуации мы внедрили датчики pH в рубец сухостойных коров и далее наблюдали динамику pH (рис. 4) в раздое.

Рис. 4. Динамика pH в рубце в условиях низкой и высокой нагрузки токсинов

Как оказалось, в обоих группах раздойных коров pH находился в кислой зоне в течение длительного времени, что коррелировало с низкой биоусвояемостью и наличием признаков ацидоза в рубце. Очевидно, что в присутствии только лактата в рубце уже не может быть проявлений «диауксии», таких как деградация сложных молекул, а следовательно, и деградации токсинов. Далее мы усилили состав Фунгистат ГПК незаменимыми факторами роста микробиоты, в том числе для лактат-утилизаторов, пребиотиками и пробиотиками и подобрали дозировку продукта, наблюдая за изменением биоусвояемости и динамикой pH в группе коров с повышенной токсичной нагрузкой. В итоге мы получили необходимую форму изменения pH в рубце (рис. 5), когда быстро накапливаются кислые продукты (снижение pH до 6,4–6,6), которые затем утилизируются в системе биогенеза молока, при этом pH возрастает до 6,9–7,2.

Рис. 5. Схема изменений pH в рубце при введении в рацион новой композиции Фунгистата ГПК

Мы полагаем, что это могут быть уже частично условия голода, способствующие проявлению «диауксии» и распаду сложных молекул, в том числе токсинов. Полученный автоколебательный процесс изменений pH обеспечивает хорошую биоусвояемость (рис. 3) и заметно улучшенный (до 85%) характер  «персистентности» лактационной кривой (рис. 2, кривая 2), что соответственно повысило и молочную продуктивность. 

Это, на наш взгляд, можно объяснить усилением активности микробиоты рубца в отношении токсинов. Полученные результаты показывают, что улучшенная композиция нейтрализатора токсинов Фунгистата ГПК позволила в дополнение к сорбционной активности задействовать естественный эффективный механизм деградации токсинов, используя активированную микробиоту рубца.

Количество показов: 734
Автор:  М. Малков, профессор; Н. Малков, PhD; Т. Данькова, канд. экон. наук, ООО «НПФ «ЭЛЕСТ»
Компания:  ЭЛЕСТ