Корма и кормовые добавки

Новый патоген угрожает сельскохозяйственному птицеводству 22.10.2021

Новый патоген угрожает сельскохозяйственному птицеводству

NEW PATHOGEN THREATS AGRICULTURAL POULTRY

К нам обратились специалисты одной из птицефабрик для помощи в идентификации возбудителя вторичной бактериальной инфекции бройлеров, возникшей на фоне инфекционного вирусного бронхита. Поскольку компания «БИОТРОФ» проводит анализы анонимно, название предприятия не раскрывается. Заболевание достигло масштабов эпифитотии, приводя к массовому падежу птицы. При патологоанатомическом вскрытии павших цыплят на птицефабрике ветеринарные врачи отмечали поражения печени, сердца, яйцеводов, которые были симптомами острой фазы заболевания; более поздними симптомами были аэросаккулиты. Причиной заболевания явилась вторичная бактериальная инфекция, протекающая по типу септицемии.

Системная инфекция была связана с иммуносупрессивным состоянием, вызванным вирусным инфекционным бронхитом кур. В молекулярнобиологической лаборатории НПК «БИОТРОФ» был проведен анализ патологического материала от птиц и образцов кормов, а также кормовых добавок методом NGS-секвенирования.

НОВЫЙ УРОВЕНЬ ДИАГНОСТИКИ

Лаборатории, практикующие классические высевы на питательные среды, закономерно испытывают трудности при выделении патогенов, поскольку инфекционные агенты, как правило, медленно растут на питательных средах — их рост подавляет вторичная микробиота, либо они вообще не имеют способности к культивированию. Поэтому в настоящее время целесообразно на птицеводческих предприятиях использование молекулярно-генетических методов идентификации возбудителей заболеваний.

В лаборатории НПК «БИОТРОФ» функционирует единственный в России Центр молекулярно-генетических исследований микробиома сельскохозяйственных животных (рис. 1). Применяемый специалистами метод NGS-секвенирования 16S-региона рРНК бактерий позволяет определить все 100% микроорганизмов в сообществе, включая некультивируемые формы.

Центр молекулярно-генетических исследований НПК «БИОТРОФ»

Рис. 1. Центр молекулярно-генетических исследований НПК «БИОТРОФ»

Как показали анализы методом NGS-секвенирования патологического материала (7 образцов печени, сердца, яйцеводов и тонкого кишечника), отобранного от больных бройлеров, причиной внезапной гибели птиц явилось развитие вторичной бактериальной инфекции на фоне вирусного инфекционного бронхита, вызванной бурным преимущественным ростом микроорганизма Acinetobacter radioresistens (рис. 2). Инфекция привела к заболеванию, которое вызвало системные изменения внутри организма птицы.

микробиота, БИОТРОФ, NGS-секвенирование

Рис. 2. Состав микробиоты патологического материала, отобранного от больных бройлеров методом NGS-секвенирования

На сегодняшний день метод NGS-секвенирования — единственный метод точной идентификации Acinetobacter radioresistens до вида. Другие современные системы идентификации, такие как MALDI-TOF масс-спектрометрия, не получили признания для типирования видов Acinetobacter.

ЛЕЧИЛИ НЕ ОТ ТОГО

Многие виды рода Acinetobacter, когда-то считавшегося организмами с низкой вирулентностью, на сегодняшний день являются клинически значимыми патогенами. Ранее роль микроорганизмов Acinetobacter sp. недооценивалась в связи с отсутствием адекватной возможности идентификации. О биологии рода Acinetobacter известно, что это грамотрицательные аэробные немотильные бактерии, имеющие характерную коккобациллярную морфологию (рис. 3). Оптимальная температура роста обычно составляет 37°C.


Бактерии рода Acinetobacter

Рис. 3. Бактерии рода Acinetobacter (сканирующая электронная микроскопия)


Принято считать, что среди различных видов ацинетобактера Acinetobacter baumannii — это наиболее распространенный патоген, вызывающий широкий спектр инфекций, но изучается он в основном в связи с заболеваниями человека. Пневмония и бактериемия у людей с ослабленным иммунитетом являются наиболее распространенными проявлениями A. baumannii в отделениях интенсивной терапии. Действительно, Американское общество инфекционных заболеваний (IDSA) классифицировало A. baumannii как один из шести бактериальных патогенов (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, A. baumannii, Pseudomonas aeruginosaи, Enterobacter spp.), которые представляют непосредственную угрозу для здравоохранения США, поскольку они в совокупности вызывают большинство внутрибольничных инфекций и проявляют устойчивость ко многим доступным в настоящее время антибиотикам.

Однако к 2013 году в связи с развитием молекулярно-биологических методов идентификации стало появляться достаточно много сообщений об инфекциях A. baumannii у сомов, свиней, крупного рогатого скота и уток в Китае, демонстрирующих тенденцию к увеличению случаев заражения A. baumannii у сельскохозяйственных животных.
В 2016 году применение секвенирования 16s рРНК позволило идентифицировать штамм A. baumannii CCGGD201101, ставший причиной массовой гибели цыплят в китайской провинции Цзилинь (Liu et al., 2016).

В публикации отражены данные о клинических симптомах при поражении бройлеров A. baumannii CCGGD201101, которые включали спастичность и ригидность конечностей (рис. 4А), оральное кровотечение (рис. 4Б) и отеки желчного пузыря (рис. 4В).

Патологоанатомическая картина поражений бройлеров

Рис. 4. Патологоанатомическая картина поражений бройлеров A. baumannii: А — спастичность и ригидность конечностей (белые стрелки); Б — оральное кровотечение (черная стрелка); В — отек желчного пузыря (черная стрелка).


Коллективом ученых (Wani, Samanta, 2006) был описан также факт инфицирования цыплят-бройлеров другим видом ацинетобактерий — Acinetobacter iwoffii, который вызывал респираторный дистресс, диарею и поражение конечностей, что приводило к гибели птиц.

Исследователями был сделан вывод, что употребление недоваренного мяса от пораженной птицы может привести к заражению человека. Выявленный нами возбудитель септицемии бройлеров Acinetobacter radioresistens ранее был известен лишь как патоген, опасный для человека, и описан в нескольких случаях пневмонии, бактериемии и септицемии. Выделение и идентификация этого патогена классическими методами микробиологии, а также биохимическими методами практически невозможны.

Вероятность ошибочной идентификации A. radioresistens с помощью таких методов ставит вопрос об истинной эпидемиологии этого организма. Вполне вероятно, что некоторые из ранее зарегистрированных инфекций сельскохозяйственных животных и птицы, вызванных другими видами Acinetobacter или микроорганизмами из родственных таксонов, на самом деле были вызваны A. radioresistens.

На современном этапе применение NGS-секвенирования 16S-региона рРНК будет способствовать повышению точности идентификации и эпидемиологического надзора за этими патогенами.

ИСТОЧНИКИ ИНФЕКЦИИ

Что касается уровня вирулентности A. radioresistens, то данный микроорганизм входит в группу условно-патогенных обитателей пищеварительной системы птиц и в норме выполняет функции, аналогичные функциям представителей нормофлоры. Тем не менее результаты проведения полногеномного секвенирования A. radioresistens (Crippen et al., 2018), выделенного из кишечника бройлеров, показали, что в геноме данного вида присутствует значительное количество белков, связанных с вирулентностью.

Хорошо известно, что кишечные капилляры могут транспортировать бактерии и их токсины в печень через портальную систему, а бактерии и эндотоксины являются нормальным компонентом портальной венозной крови. В норме кишечные токсины и бактерии, попадающие в печень через портальную систему, выводятся клетками Купфера и ретикулоэндотелиальными клетками печени. Однако на фоне иммуносупрессий у птиц бактерии, в частности A. radioresistens, и эндотоксины, содержащиеся в портальной крови, могут вызывать повреждение гепатоцитов. Постоянная антигенная стимуляция печени, связанная с дисбалансом микрофлоры кишечника и аномальными реакциями организма на антигены из-за нарушения работы иммунной системы, может привести к длительной воспалительной реакции и гепатиту, проявляющемуся в виде гранулем в печени.

Возникшая септицемия может вызвать целый ряд заболеваний, в том числе пневмоаккулит, токсикоз, перикардиты и др.

Мы предположили, что в нашем исследовании на фоне снижения иммунитета у птиц вследствие вирусного инфекционного бронхита произошел дисбаланс кишечной микрофлоры, из-за чего целостность кишечного барьера могла быть нарушена. По этой причине печень утратила способность эффективно нейтрализовать бактерии и токсины, проникающие из кишечника, что привело к повышению восприимчивости организма к вторичным инфекциям.

Для поиска решения было проведено исследование микробиологического состава используемых на птицефабрике кормов и кормовых добавок. Оказалось, что имеющиеся проблемы — это во многом результат низкого качества пробиотика (европейского производства), применяемого на бройлерах, а заражение A. radioresistens, вероятно, произошло пероральным путем.

Дело в том, что производителем заявлен следующий состав пробиотика: Enterococcus fаесium, Bifidobacterium animalis, Lactobacillus salivarius.

Реальный же состав препарата практически не соответствовал заявленному (рис. 5). Более того, в составе пробиотика в значительном количестве (10,5%!) выявлялись патогенные бактерии того самого вида, который был связан с падежом птицы, — Acinetobacter radioresistens.


состав пробиотика


Рис. 5. Реальный состав пробиотика европейского производства методом NGS-секвенирования, %


Выпуск таких биопрепаратов — это стремление быстро наполнить рынок и удовлетворить спрос потребителя.

В чем же причина несоответствия пробиотика?

Дело в том, что в погоне за удовлетворением потребительского спроса практически никто из производителей пробиотиков не желает тратить время и нести колоссальные финансовые затраты, так как грамотная разработка пробиотика с нуля до финального продукта занимает около 20 лет. Пробиотики, возникшие ниоткуда, — это своего рода лотерея, и никогда нельзя знать наверняка, соответствует ли состав паспорту качества и какой ожидается эффект. Поэтому к любой рекламе без отсутствия доказательной базы нужно относиться критически.

Ошибки могут быть не только на этапе разработки, но и в процессе производства. Так, эксплуатация ферментеров, необходимых при производстве пробиотических бактерий, связана со многими факторами риска. К первой группе факторов относятся риски, связанные с необходимостью защиты культивируемых микроорганизмов от заражения посторонней микрофлорой. Специалистам известно, что в масштабах производства существует множество источников заражения культуры, в том числе нестерильные воздушные фильтры, контаминация при внесении посевной культуры, упаковка в нестерильную тару и др. Поскольку в ферментере находится богатая питательная среда, благоприятная для развития микроорганизмов различных физиологических групп, при несоблюдении хотя бы одного из пунктов технологии, а также при использовании устаревшего оборудования неизбежны контаминация и бурное размножение посторонней микрофлоры. Ко второй группе относятся риски, связанные с управлением процессами ферментации. Так, например, есть микроорганизмы, которые относятся к категории труднокультивируемых даже в условиях лаборатории, не говоря уже о производстве.

К третьей группе риска относятся бактериофаги — вирусы бактерий, которые поражают целевую бактериальную культуру, и место в ферментере «освобождается» для нежелательной микрофлоры.

Качество препаратов обеспечивается не только соблюдением требований надлежащей производственной практики, но и системой контроля на этапах производства и проверки готовой продукции. На базе большинства предприятий отсутствуют молекулярно-биологические лаборатории, способные точно оценить полный состав и количество микроорганизмов в препаратах.

Нужно также учитывать тот факт, что производство многих препаратов за рубежом компаниями идет «для России». Грубо говоря, в понедельник, среду и пятницу препарат производится для поставки в Евросоюз, что определяет более жесткий контроль при производстве и «на выходе», а во вторник и четверг — в Россию.

Контролирующие инстанции всегда имеют возможность внезапно прийти на завод, расположенный в России, изъять образцы препарата, проверить их качество, условия, в которых препарат производится. В отношении зарубежных производителей такой возможности нет.

СЛОЖНОСТИ ТАКТИКИ ЛЕЧЕНИЯ

Многие штаммы ацинетобактерий обладают полисахаридной капсулой, которая, как правило, является показателем высокой вирулентности. Капсула состоит из полисахаридов и полипептидов, которые защищают клетки бактерий от фагоцитоза иммунной системой хозяина. Кроме того, она позволяет бактериям легко прикрепляться к поверхностям, включая различные органы и ткани организма-хозяина, и предохраняет клетки от обезвоживания. Поэтому ацинетобактерии часто устойчивы к высыханию и дезинфицирующим средствам, успешно сохраняются в окружающей среде в течение длительного времени.

Имеющиеся у ацинетобактерий пили представляют собой многофункциональную поверхностную структуру, которая способствует адгезии патогена к клеткам-хозяевам и другим поверхностям, участвует в инвазии клеток-мишеней, колонизации в процессе инфицирования, инициирует образование биопленок, участвует в переносе электронов, поглощении ДНК, а также рассматривается как внешний токсин.

С другой стороны, устойчивость бактерий к антибиотикам растет значительными темпами, что вызывает тревогу как у медиков, так и у ветеринаров. Как оказалось, ацинетобактерии обладают высокой способностью приобретать широкий спектр генов устойчивости к антибиотикам.

В частности, вид Acinetobacter baumannii входит в список патогенов ВОЗ с критически высоким уровнем приоритетности для НИОКР в области создания новых антибиотиков. При исследовании генома A. radioresistens (Crippen et al., 2018) были идентифицированы несколько систем множественного лекарственного оттока и другие гены (хлорамфениколацетилтрансфераза, ферменты b-лактамазы, пути резистентности к фторхинолонам), имеющие отношение к устойчивости к противомикробным препаратам.

В дополнение были найдены гены белков, участвующих в резистентности к окислительному стрессу, углеродному голоданию, детоксикации радикальных форм кислорода, осмотической толерантности к стрессу, секреции и экспорту колицина V.

Все эти особенности указывают на то, что ацинетобактерии являются мультирезистентными к лекарственным препаратам, экологически устойчивыми и способными к множественным механизмам генетического обмена, что делает их идеальным резервуаром для распространения устойчивости к противомикробным препаратам.

Поэтому тактика лечения при инфицировании ацинетобактериями включает применение комбинаций антибиотиков. Схема лечения обычно состоит из двух или трех классов следующих антибиотиков: полимиксины, рифампицин, тигециклин, сульбактам, аминогликозиды или b-лактам (цефалоспорины или карбапенемы широкого спектра действия). Фосфомицин, ингибитор биосинтеза пептидогликана, хотя и не обладает активностью против ацинетобактерий, проявляет in vitro синергизм с колистином и сульбактамом для лечения устойчивых к карбапенемам ацинетобактерий. Антимикробный пептид ликозин-I проявляет выраженную антибактериальную активность in vitro в отношении мультирезистентных ацинетобактерий.

АЦИНЕТОБАКТЕРИИ В ПРОДУКЦИИ ПТИЦЕВОДСТВА

В последние 10–15 лет в мировой медицине наметилась тенденция к увеличению в общей структуре кишечных инфекций и бактериальных отравлений удельного веса заболеваний, связанных с пищевым путем передачи инфекций.

Нарастающая озабоченность мировой общественности проблемой микробиологической безопасности продуктов питания обусловила появление концепции «эмерджентных пищевых инфекций». По определению ВОЗ, эмерджентные инфекции — это болезни (и возбудители), возникающие или появляющиеся внезапно и этим обуславливающие чрезвычайные эпидемиологические ситуации, как правило, очень напряженные.

Согласно исследованиям, ацинетобактерии относятся к возбудителям эмерджентных пищевых зоонозов, поскольку для них характерна широкая распространенность в природе, а также способность не только выживать, но и размножаться во внешней среде и пищевых продуктах. Acinetobacter sp. довольно толерантны к некоторым консервирующим факторам.

Они могут расти при низких температурах и при низком уровне рН (до 3,3), способны выдерживать воздействие 0,7% перекиси водорода и 10 ppm озона. Несмотря на строгую аэробность, виды рода Acinetobacter были выделены из говядины в вакуумной упаковке после 6-недельного хранения при температуре 2°C.

Беттсом (Betts, 2006) в промышленно обработанных продуктах птицеводства были идентифицированы изоляты рода Acinetobacter, наиболее часто выделялись виды A. radioresistens и A. baumanii. При хранении в холодильнике данной продукции наблюдалось значительное увеличение популяции бактерий.

Следует отметить высокую способность ацинетобактерий в короткие сроки превращаться в возбудителей острых пищевых инфекций с тяжелым течением и высоким процентом летальных исходов. Симптомы инфекции у людей могут появиться от 4 до 40 дней после инфицирования, но в среднем они возникают в течение 10–12 дней.

Вывод. На наш взгляд, специалистам птицеводческих предприятий необходимо принять во внимание новую информацию об опасности Acinetobacter radioresistens для птиц и людей — потребителей продукции птицеводства, чтобы не пропустить возникшую угрозу. Полученные знания обосновывают необходимость разработки новых критериев в системе санитарно-эпидемиологического контроля продовольственного сырья и готовой продукции, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных методов молекулярно-генетического анализа.

Поскольку заражение A. radioresistens явилось нежелательным эффектом введения в рацион птицы с ослабленным иммунитетом пробиотиков низкого качества, следует помнить, что разработка и производство пробиотиков — это сложные наукоемкие технологические процессы, требующие больших интеллектуальных вложений (иначе и быть не может, поскольку мы вмешиваемся в сложные процессы микробиологии, метаболизма и иммунитета животных). Поэтому перед покупкой стоит узнать чуть больше о производителе препарата, при этом не так важна страна производства.


Резюме. Разработка и производство пробиотиков — это сложные наукоемкие технологические процессы, требующие больших интеллектуальных вложений. Поэтому перед покупкой пробиотика стоит удостовериться в надежности производителя. Так, заражение кур A. radioresistens явилось следствием введения в рацион птицы с ослабленным иммунитетом пробиотиков низкого качества. Практика показывает необходимость подбора новых критериев в системе санитарно-эпидемиологического контроля продовольственного сырья и готовой продукции, в том числе на основе создания и внедрения высокочувствительных и эффективных методов молекулярно-генетического анализа.

Summary. The development and production of probiotics are complex high-tech technological processes that require large intellectual investments. Therefore, buying a probiotic, you should make sure that the manufacturer is reliable. Thus, infection of chickens with A. radioresistens resulted from the introduction of low quality probiotics into the diet of immunocompromised poultry. Practice shows the need to select new criteria in the system of sanitary and epidemiological control of food raw materials and finished products, including through the creation and implementation of highly sensitive and effective methods of molecular genetic analysis.

 

ЛИТЕРАТУРА

1. Liu D., Liu Z.S., Hu P. et al. Characterization of a highly virulent and antimicrobial-resistant Acinetobacter baumannii strain isolated from diseased chicks in China // Microbiol Immunol. 2016 Aug; 60(8):533–9. doi: 10.1111/1348–0421.12400. PMID: 27399903).

2. Wani S.A., Samanta I., Banday M.T., Bhat M.A. Isolation of Acinetobacter iwoffii from broiler chicken with septicemia in Kashmir valley // Medicine Indian Journal of Animal Research. 2006; 44(2): 39–42.

3. Crippen C., Huynh S., Miller W.G., Parker C., Szymanski C.M. Complete genome sequence of Acinetobacter radioresistens strain LH6, a multidrug-resistant bacteriophage-propagating strain // Microbiology Resource Announcements. 2018; 7 (5): e00929-18. https://doi.org/10.1128/ MRA.00929-18.

4. Betts G. Other Spoilage bacteria // Food Spoilage Microorganisms. 2006. P. 668–694.














Количество показов: 490
Автор:  Г. Лаптев, Н. Новикова, Е. Йылдырым, Д. Тюрина, Л. Ильина, А. Дубровин, В. Филиппова, ООО «БИОТРОФ» / G. Laptev, N. Novikova, E. Iyldyrym, D. Tiurina, L. Ilina, A. Dubrovin, V. Filippova, LLC Biotrof
Компания:  БИОТРОФ

Возврат к списку


Материалы по теме: